2024-12
反相高效液相色谱（RP-HPLC）是医药、食品、环保等行业中应用最广泛的一种分析方法，具有分离效率高，选择性好，灵敏度高等特点。
反相高效液相色谱分析方法开发过程中，固定相和流动相的选择决定着方法的分离效果。目前，色谱柱填料纯度和种类、色谱柱规格及填充工艺均日益改进，为分析工作者提供了更丰富的硬件选择。流动相的选择包括有机相的种类、混合比例、添加剂和pH值等，选择合适的流动相对于液相色谱的分析至关重要。
在分析方法开发或使用过程中，流动相添加剂选择或使用不当，不仅会导致分离效果不达预期，甚至可能导致色谱柱或仪器的损坏，因此，流动相的正确选择是分析工作者必须具备的基本功。本文就流动相中添加剂的选择和使用注意事项进行简要分享，以期为分析工作者提供借鉴。
反相流动相中的常见添加剂
在涉及到药物分析时，由于大多数药物是可电离的，即酸性、碱性或两性离子。一般情况下需要通过在水中加入pH调节剂、缓冲盐等添加剂，抑制样品组分解离或与待测组分“结合”，从而实现组分合理保留并拥有良好峰型的目的。
常见的流动相添加剂包括有磷酸盐缓冲液、铵盐缓冲液、三氟乙酸、三乙胺、离子对试剂等，具体见表1。
*在截止波长附近或以下的波长进行操作时，会由于溶剂的吸光度而增加基线噪音。最适用的流动相是在选定检测波长处无背景吸收的流动相。使用这种流动相，可确保任何吸光度只和样品有关。[1]
本文将针对几类常用且使用过程中需要特别注意的添加剂简要介绍如下，并对缓冲盐浓度的选择给出建议。
一、三乙胺的作用原理和合理使用
1.作用原理
色谱柱键合相上残留的硅羟基容易与碱性化合物结合而造成峰脱尾，在流动相中加入碱性的三乙胺后，三乙胺与硅羟基结合，从而阻碍了样品中碱性化合物与硅羟基的作用，可以减少峰拖尾。
2.使用注意事项
1）三乙胺的碱性很强，建议不要单独使用，最好与其它试剂组成缓冲体系，并在加入三乙胺后调节pH值至目标值。一般用量在流动相体积的0.1%~0.3%。
2）三乙胺截止波长较高，液相方法中的检测波长在低波长端时需要谨慎使用。
二、离子对试剂的作用原理和合理使用
1.作用原理
使用反相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品组分在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，它可以与待分析的组分结合成离子对而呈中性，疏水性增加而在色谱柱上有保留行为。离子对类似于胶黏剂，一端以离子吸引住待测组分，另一端以碳链与固定相作用，从而把待测组分保持在固定相上。
若分析物为强碱性化合物，通常会在流动相中添加烷基磺酸盐离子对试剂，如戊烷磺酸钠；若分析物为强酸性化合物，通常流动相中会添加四烷基铵盐或烷烃铵盐离子对试剂，如四丁基溴化铵。经过长时间的色谱柱平衡，流动相中离子对试剂的疏水端（烷基部分），与固定相长链强力吸引；亲水端（磺酸阴离子或氮正离子）则暴露于固定相与流动相的相界面上。当被分析离子化合物进入色谱柱时，强碱性化合物/强酸性化合物与相界面上的磺酸阴离子/氮正离子产生静电作用，从而产生保留。
2.离子对流动相pH要求[3]
考虑到烷烃磺酸pKa约为1，强碱性化合物pKa约为9，为保证烷烃磺酸与强碱化合物均完全离子化，流动相的pKa应偏离二者的pKa至少2个单位，故在用离子对色谱法分析强碱性化合物时，流动相的pH应在3~7的范围。考虑到四烷基铵盐或烷烃铵盐pKa约为10，强酸性化合物pKa约为2，同理可得，当在用离子对色谱法分析强酸性化合物时，流动相的pH应在4~8的范围。可选的缓冲盐有磷酸盐（pKa3.2&7.2）、甲酸盐（pKa3.8）、乙酸盐（pKa4.7）。如若要在同一个分析方法中同时实现强酸与强碱化合物的保留时，可在流动相中同时添加烷基磺酸盐离子对试剂以及四烷基铵盐或烷烃铵盐离子对试剂，同时维持流动相的pH在4~7即可。
3.使用注意事项
1）当使用的离子对试剂疏水性较强（如烷基磺酸盐）或季铵盐试剂（如四丁基铵）时，柱平衡通常较慢，需要注意基线稳定性和保留值重现性。
2）若发现选择的离子对试剂不合适而想换一种离子对试剂时，如果不更换色谱柱，最好先充分清洗原来色谱柱中的离子对试剂，再用新流动相平衡色谱柱。不同的离子对试剂有不同的清洗方法：
对于阴离子试剂：用50%~80%的甲醇-水清洗；
对于季铵盐类试剂：用50%甲醇-缓冲剂（100~200 mM）（如pH4~5，100mM磷酸钾）清洗，其中加入磷酸钾的目的是降低试剂铵基与硅羟基发生作用。
3）离子对试剂对色谱柱的影响
如果使用的离子对试剂疏水性非常强，那么它会在固定相上产生持久的保留，对色谱柱产生不可逆的的改性。因此需要专柱专用，特别在开发新方法的时候，不要使用这种被改性过的柱子，不然可能在使用新柱子时不能重现原来的结果。
三、离液盐试剂的作用原理及应用
离液盐试剂，常用的有高氯酸根离子、三氟乙酸跟离子、四氟硼酸根离子以及六氟磷酸根离子，主要应用于碱性质子化合物分析。
1.作用原理
随着色谱柱平衡，固定相疏水表面会富集形成亲脂的有机相层（如甲醇、乙腈），亲脂的离液阴离子会在有机相界面富集，形成具有阳离子交换性质的“伪固定相”层。当被分析的碱性质子化合物进入色谱柱时，离液阴离子会破坏分析物的溶剂化分子层，通过静电作用，形成“碱质子化合物-离液阴离子”中性化合物，从而产生或增强保留。[3]
2.应用品种
中国药典二部2020年版项下的左氧氟沙星、盐酸丙米嗪、雷米普利等碱性化合物品种均在流动相中加入了高氯酸钠。
四、无机盐类添加剂的使用浓度要求
1.无机盐添加剂的析出风险
当流动相为有机物和含盐缓冲液时，随着有机物比例增加，会使无机盐溶解度降低，当有机物比例超过一定数值时，无机盐就会析出。缓冲盐溶液在HPLC泵头内极易出现高压盐析现象，磨损密封垫，所以一般将缓冲盐浓度选定在5mM～50mM。
在药品有关物质分析方法中，经常使用梯度洗脱，程序后段为有机相比例较高的强洗脱，以保证所有成分充分洗脱，此时需要注意有机相最高比例，避免缓冲盐析出，以保护色谱柱。
另外，随着有机相比例的升高，流动相的pH值也会相应上升，当超过色谱柱允许的pH值范围，会导致柱内硅胶溶解而损坏色谱。[5]
2.无机盐添加剂的使用浓度安全范围
缓冲盐的浓度和有机相比例的确定，需要综合分离效果、盐析风险、pH影响来进行选择，必要时进行柱外模拟实验，也可借鉴已有法定方法进行评估。
本文以磷酸二氢钾缓冲盐为例，对中国药典二部2020年版项下的化学药品种进行了筛选，将流动相中“磷酸二氢钾浓度大于20mM”且“有机相比例大于35%”的典型品种列举如下，为缓冲盐的析出风险安全范围提供一定数据参考。
参考资料：
[1] Waters：Alliance iS HPLC Systems 用户指南
[2] HPLC and UHPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, 2019
[3] 浅谈RP-HPLC中离子对试剂与离液剂的异同及应用 药事纵横 2022
[4] 《中国药典》2020年版 二部
[5] 含盐流动相损坏色谱柱原因探讨 章志青 山东化工 2009
